节段型白癜风皮损区角朊细胞表达干细胞因子的实验研究

抱住我的生命 · 发表于 2006-6-14 17:08:54

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提　要　目的：了解节段型白癜风皮损区角朊细胞(KC)表达干细胞因子(SCF)的状况。方法：采用原位杂交及免疫组化技术对8例活动期和9例稳定期节段型白癜风患者皮损KC内SCF的表达进行了观察。结果：活动期皮损KC表达SCF明显增强，稳定期皮损与正常皮肤KC的表达状况无显著差异。结论：稳定期皮损KC内SCF的正常表达为黑素细胞(MC)自体移植治疗节段型白癜风，移植MC能够长期存活提供了一定的实验依据，活动期KC内SCF表达增强提示SCF可能参与了该型白癜风的发病。 　　 　　关键词：节段型白癜风　黑素细胞　角朊细胞　干细胞因子 
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align=left>　　近年体外研究发现角朊细胞(Keratinocyte,KC)能产生多种影响黑素细胞(MC)生物学性状的细胞因子［1］，其中，干细胞因子(Stem cell factor,SCF)是较为重要的一种。已发现SCF对MC的发育、存活和增殖也有着明显的作用。白癜风的基本病理改变是表皮内的MC减少或消失，其发生的确切原因仍不清楚，作为MC生存的“土壤”，与MC发生密切接触的KC是否参与了疾病的发生是近年来人们所关注的问题。了解KC所分泌的细胞因子在不同病期节段型白癜风皮损处KC的表达状况，为判断MC自体移植治疗白癜风后白斑区MC的转归提供一定的实验依据，以及进一步认识该病的发生机制，均有一定意义。为此，本实验采用原位杂交和免疫组化的方法，观察了节段型白癜风皮损区KC表达细胞因子SCF的状况。
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>　　1　材料与方法
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>　　1.1　病例 　　胸背部节段型白癜风患者，男11例，女6例，年龄16～38岁，病程平均7.5年，其中活动期8例，稳定期9例，取材部位为白斑与正常皮肤交界处的白斑皮肤。正常对照采用胸背皮肤，共8例。所有标本取材后立即放入液氮冻存备用。患者分型、分期参照文献［2］进行。 　　1.2　基因探针的制备及原位杂交［3，4］ 　　重组有0.6 kb SCF cDNA的pUC18质粒由军事医学科学院朱元晓副研究员惠赠。按常规方法进行质粒的提取及纯化；根据SCF cDNA在质粒中的克隆位点，酶切获得约0.5 kb的SCF cDNA片段，电洗脱法回收酶切片段后，地高辛标记探针(非放射性DNA标记及检测试剂盒为德国宝灵曼公司产品)，标记过程按试剂盒规定步骤进行。将冻存组织块置入30%蔗糖溶液中过夜，做20 μm厚冰冻切片，用漂片法按常规进行。杂交过程中所用的器皿和液体均严格按无RNase要求处理。 　　阴性对照设置3种：①以不加探针的杂交液进行杂交；②切片在杂交前用RNase处理；③先用等量的未标记探针杂交后再用标记探针杂交。 　　1.3　免疫组化染色 　　将冻存皮肤组织作4μm厚的冰冻切片，丙酮固定；采用S-P免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发公司产品)染色，按试剂盒规定步骤进行，一抗是抗SCF单克隆抗体(由军事医学科学院朱元晓副研究员惠赠)，工作浓度1∶60。以1∶40的正常兔血清代替一抗作为阴性对照。 　　1.4　结果判断 　　在排除非特异性染色的情况下，原位杂交以胞浆内出现淡蓝色颗粒为阳性，每张切片在400倍镜下随机选择10个视野，计数每个视野中的阳性细胞，每例计数10张切片，取其平均值，作为该例标本的原位杂交阳性数。 　　免疫组化以细胞浆或细胞膜出现黄棕色为阳性，根据染色强度分为5级：(-)阴性；(±)淡棕色，弱阳性；(+)阳性；(++)棕色，中度阳性；(+++)褐色，强阳性［5］。 　　1.5　统计学处理 　　实验结果用t检验和χ2检验进行统计学分析。
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>　　2　结果
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>　　2.1　原位杂交 　　正常皮肤及皮损区表皮内均可见到SCF mRNA的表达，阳性细胞以基底层和棘层细胞为主。正常表皮与稳定期皮损内SCF mRNA的表达阳性细胞数之间无明显差异；活动期皮损KC的表达信号明显增强，阳性细胞增多(P<0.05)。真皮内可见散在分布的阳性细胞，见表1及图1、2。
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align=center><IMG src="http://www.vitiligo-china.net/paper/20000597601.gif">
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align=center>图1　正常皮肤SCF mRNA表达　(原位杂交×400) Fig 1　Expression of SCF mRNA in normal skin　(in situ hybradization×400)
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align=center><IMG src="http://www.vitiligo-china.net/paper/20000597602.gif">
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align=center>图2　活动期皮损SCF mRNA表达　(原位杂交×400) Fig 2　Expression of SCF mRNA in active lesion　(in situ hybradization×400)
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align=center>表1　节段型白癜风皮损区KC内表达 SCF mRNA的观察(X±s) Tab 1　The expression of SCF mRNA in KC of segmental vitiligo lesions(X±s)
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<TABLE border=1>

<TR>
<TD align=middle rowSpan=2>　</TD>
<TD align=middle colSpan=3>Number of positive cells</TD></TR>
<TR>
<TD align=middle>Normal</TD>
<TD align=middle>Stable</TD>
<TD align=middle>Active</TD></TR>
<TR>
<TD align=middle>n</TD>
<TD align=middle>8</TD>
<TD align=middle>9</TD>
<TD align=middle>8</TD></TR>
<TR>
<TD align=middle>SCF</TD>
<TD align=middle>8.5±2.2</TD>
<TD align=middle>9.1±2.3</TD>
<TD align=middle>14.7±4.5*</TD></TR></TABLE></CENTER></DIV>*：P<0.05 vs normal and stable
　　阴性对照：所采用的三种阴性对照方法结果均为阴性。 　　2.2　免疫组化染色 　　皮损区及正常对照皮肤KC均表达SCF蛋白，阳性细胞为细胞膜着色，其分布在二者之间未见明显差异，仍是以基底层和棘层细胞为主，稳定期皮损与正常皮肤之间阳性强度无显著差异；活动期皮损区KC表达SCF蛋白则明显增强，阳性细胞增多。正常表皮和稳定期皮损表皮基底层可见树突状细胞染色呈阳性，真皮内也可见散在阳性细胞，见表2和图3、4。
表2　SCF蛋白在节段型白癜风皮损表皮内KC的表达 Tab 2　The expression of SCF protein in KC lesions of segmental vitiligo
<DIV align=center>
<CENTER>
<TABLE border=1>

<TR>
<TD align=middle rowSpan=2>　</TD>
<TD align=middle rowSpan=2>n</TD>
<TD align=middle colSpan=5>SCF</TD></TR>
<TR>
<TD align=middle>-</TD>
<TD align=middle>±</TD>
<TD align=middle>+</TD>
<TD align=middle>++</TD>
<TD align=middle>+++</TD></TR>
<TR>
<TD align=middle>Normal</TD>
<TD align=middle>8</TD>
<TD align=middle>0</TD>
<TD align=middle>1</TD>
<TD align=middle>5</TD>
<TD align=middle>2</TD>
<TD align=middle>0</TD></TR>
<TR>
<TD align=middle>Stable</TD>
<TD align=middle>9</TD>
<TD align=middle>0</TD>
<TD align=middle>3</TD>
<TD align=middle>6</TD>
<TD align=middle>0</TD>
<TD align=middle>0</TD></TR>
<TR>
<TD align=middle>Active*</TD>
<TD align=middle>8</TD>
<TD align=middle>0</TD>
<TD align=middle>0</TD>
<TD align=middle>1</TD>
<TD align=middle>3</TD>
<TD align=middle>4</TD></TR></TABLE></CENTER></DIV>*：P<0.05 vs normal
<IMG src="http://www.vitiligo-china.net/paper/20000597603.gif">
图3　正常皮肤SCF mRNA表达　(免疫组化染色×400) Fig 3　Expression of SCF mRNA in normal skin　(Immunohistochemical stain×400)
<IMG src="http://www.vitiligo-china.net/paper/20000597604.gif">
图4　活动期皮肤SCF mRNA表达　(免疫组化染色×400) Fig 4　Expression of SCF mRNA in active lesions　(Immunohistochemical stain×400)
　　3　讨论
　　SCF是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，其受体c-kit蛋白，是一个膜型的酪氨酸激酶。在小鼠，若编码SCF的S1位点或编码c-kit的位点W发生突变，可导致小鼠无生殖能力并伴有巨细胞性贫血、皮肤无色素以及肥大细胞缺陷；给妊娠小鼠注射抗kit蛋白的抗体可使子代小鼠皮肤MC减少出现点状白斑。在人类，现已证实斑驳病就是一种由于kit基因的突变引起受体表达减少，导致胚胎发育过程中色素母细胞异常分布的一种遗传疾病［5］。体外研究证实SCF可促进MC的黑素合成及增殖；动物实验还发现SCF是胚胎发育中MC增殖和存活的重要因素。1992年，Morita等［6］发现培养的人KC能表达SCF的mRNA并有相应蛋白的产生。 　　为了解SCF在节段型白癜风皮损内的表达状况，本实验首次采用人SCF的cDNA探针对正常皮肤及白斑区皮肤的KC表达SCF的状况进行了初步的观察。结果发现，正常皮肤部分表皮KC及真皮细胞内有SCF mRNA的表达，提示正常情况下该细胞因子的表达处于低峰度状态，进一步证实了既往的研究。在白斑区，稳定期皮损与正常皮肤之间未见明显差异，活动期皮损KC内表达则明显增强。 　　免疫组化染色观察到，正常表皮内KC表达SCF蛋白，同时观察到阳性细胞还有表皮内的树突状细胞和少许真皮内的细胞，与以往国外学者的观察相符。由于表皮内MC不表达SCF，故表皮内所看到树突状细胞应为LC［7］。在活动期，皮损KC内SCF的表达明显增强，提示SCF可能参与了节段型白癜风的发病。1995年，Dippel等［8］报道，白癜风患者皮损区的KC表达SCF状况与对照组无显著差异，1996年Norris等［9］报道4例活动期非节段型白癜风患者皮损区、交界区及外观正常皮肤之间KC的SCF表达也未见明显差异，与我们的观察结果不符，其原因可能为：①实验方法不同，Dippel等采用的是免疫荧光方法；②所观察的对象不同， Dipple未说明所观察患者的类型；Norris等观察的是5例非节段型患者。本实验所采用的抗分泌型SCF单克隆抗体，是用大肠杆菌表达的重组人SCF融合蛋白免疫小鼠获得，经ELISA和蛋白印迹实验证实了其特异性，这为实验结果的可靠性提供了保障［10］。 　　本实验所观察到SCF在节段型活动期皮损内表达增强的现象，可能是由于受体的表达量减少以致SCF反馈性地表达增强。Norris等［9］分别用抗MC的单抗和抗c-kit单抗检测了7例白癜风患者白斑与正常皮肤交界处MC的表达，结果发现交界处皮损内c-kit蛋白阳性细胞明显少于黑素糖蛋白抗体阳性细胞，故提出了MC的c-kit蛋白表达减少可能参与了白癜风的发病，但同时我们又注意到，Norris等仅观察了1例稳定期节段型白癜风患者，该例患者皮损交界处的两种单抗的阳性细胞数间并无明显差异，故在节段型白癜风，皮损与正常皮肤交界处MC的c-kit表达状况及有关机理均有待进一步研究。 　　本实验结果提示，SCF可能参与了节段型白癜风的发病，但其机制有待进一步研究。在稳定期，皮损处KC表达SCF正常，这为移植MC在白斑区的存活提供了一定的实验依据。

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